1.低溫透射電鏡技術概述
低溫透射電鏡技術是在低溫下(通常在 90K)將液相樣品中的水或其它溶劑快速冷凍固定后，在低溫環(huán)境下使用透射電鏡進行觀察的技術。低溫透射電鏡實驗要求樣品在制樣、傳輸和觀察整個過程中都保持在低溫狀態(tài)(通常低于100 K)，相對于常溫透射電鏡，其優(yōu)勢有：1)快速冷凍制樣技術將樣品固定在玻璃態(tài)的冰層中，避免了水或溶劑結晶對樣品結構的破壞，能夠保持液相中有機分子自組裝體和化學反應中間體的微觀結構，避免了樣品干燥引起的結構變化;2)高分子及化學反應體系常常具有非平衡態(tài)結構，快速冷凍制樣技術能夠保持住非平衡態(tài)結構，進而得以觀察;3)低溫條件能夠盡可能保持有機和高分子等軟物質材料的微觀結構，顯著減少電子束對樣品的損傷。
2.系統(tǒng)組成及操作流程
分析測試中心電鏡組利用現(xiàn)有儀器(Leica EM GP 全自動載網(wǎng)投入冷凍儀、Gatan 626 單傾冷凍傳輸樣品桿、Jem-2011 透射電鏡等)，開展了低溫透射電鏡工作。具體操作流程如下：
2.1 冷凍制樣
冷凍制樣的關鍵是要在載網(wǎng)上得到厚度合適的玻璃態(tài)的冰層。冷凍環(huán)境下， 樣品中溶劑(水)的粘性會顯著提高，在極高的粘性下，所有樣品組分包括水都被完全固定，不能移動。但是，當水分子結晶形成冰晶，就會破壞樣品的結構， 因此，要阻止冰晶形成，使得水成為玻璃態(tài)(vitrified), 或者稱之為非結晶態(tài)冰(無定形冰)。
水結晶的條件包括：(1)溫度必須低于熔點(常壓下水容易形成過冷水， 從 231 K 開始結晶);(2)具有晶核;(3)有足夠的能量，高于重結晶溫度(常壓下，純水的重結晶溫度約為 136K, 低于這一溫度，水分子沒有足夠的能量進行分子重排，從而無法結晶);(4)有足夠的時間分子重排。純水在 231 K～136K 的溫度范圍內經(jīng)過一定的時間可以結晶形成冰晶，所以要得到玻璃態(tài)的冰，就需要降溫時迅速通過這一溫度范圍，即要求快的冷凍速率和盡可能窄的結晶溫度范圍。
凍冷速率隨樣品厚度的變化圖
對于一定的樣品而言，水的熱擴散率和樣品厚度決定了樣品的冷凍速率[1,2]。在常壓情況下，只有當冷凍速率大于 5 105 K/s，才有足夠的時間提取熱量防止冰晶產(chǎn)生。同時，水的熱擴散率很差，對于較長距離，熱量無法有效釋放(圖 1)。例如，對于 600µm 厚的含水樣品，即使其表面冷凍速率達到理論臨界冷凍速率(> 5 105 K/s)，在距離樣品表面 150µm 處，冷凍速率也會降到低于 1000 K/s。因此，在常壓下，很難形成較厚的玻璃態(tài)的冰層。20 世紀 70 年代，Moor 引入了高壓冷凍固定法[3,4,5,6]。增加壓力到一定程度可顯著降低水分子的成核溫度， 縮短水的結晶溫度區(qū)間(圖 2)，從而增加了冷凍固定樣品的厚度。
水的相圖
在常壓下，100nm 厚水膜可以被有效玻璃化冷凍[8]，滿足此條件的樣品可以選擇投入式快速冷凍制樣法。高壓條件下，可以有效固定 200 mm 以下的厚水膜，適合此條件的樣品可以選擇高壓冷凍技術制樣法。
2.1.1 投入式快速冷凍制樣
投入式快速冷凍制樣是液相樣品進行冷凍固定的基本方法，是將樣品快速插入到液態(tài)乙烷中(90K，以液氮冷凍)，使樣品中的水/其他溶劑快速冷凍(冷凍速度可達 10,000K/s)固定于電鏡載網(wǎng)上，此過程中水和其它溶劑不結晶成為玻璃態(tài)(vitrified)，能夠最大限度的保持樣品的結構。這種制樣方法要求樣品大小、厚度、粘度等不能太大，否則可能會出現(xiàn)樣品脫落，電子束無法穿透樣品，不能通過自動吸附過程得到厚度合適的樣品薄膜等情況。
在投入式快速冷凍技術中，采用將載網(wǎng)以自由落體的形式快速投入到冷凍劑中的方式，是因為成功的冷凍固定取決于冷凍過程是否能夠迅速通過水結晶的溫度范圍，要求冷凍速度太快以至于水來不及結晶。冷凍劑選擇的是在液氮“水浴” 環(huán)境中的液化乙烷。乙烷的比熱比氮氣的比熱更大，冷凍速度更快;乙烷的沸點比氮氣高，在液氮“水浴”環(huán)境中可以液化，得到一個更加穩(wěn)定且快速的冷凍環(huán)境。
具體操作步驟為：將載網(wǎng)(一般選用 GiG-C321 型號的微篩陣列碳支持膜) 置于一個溫度/濕度可控的環(huán)境倉中，溫度可在 279K- 335K 之間調節(jié)，濕度可在大氣濕度到 99%調節(jié)(圖 3a, 3b)。在電鏡載網(wǎng)上滴加樣品懸液后(通常3μL，圖 3a)，通過濾紙自動吸附過程吸走一些樣品留下適量樣品形成電子束能夠穿透的薄膜，然后載網(wǎng)被快速投入液態(tài)乙烷中進行冷凍(圖 3c)。在投入冷凍完成后，將載網(wǎng)快速轉移到樣品盒并保存在液氮中，用于后續(xù)觀察。
a)在可控的樣品環(huán)境倉內向載網(wǎng)上滴加樣品 b) 可編程的參數(shù)設定 c)液化乙烷的頭部液化裝置
2.1.2 高壓冷凍制樣
在常壓下，技術改進并不能幫助玻璃化冷凍更厚的樣品。而高壓條件下，降低了水的結晶溫度范圍和臨界降溫速率，使得到的有效玻璃化厚度更大。因此要制備尺寸較大、粘度較高的樣品，需要通過加壓來實現(xiàn)。
Leica EM HPM100 型高壓冷凍儀冷凍曲
從 Leica EM HPM100 型高壓冷凍儀冷凍曲線圖[11]中，我們可以看出，在 10ms 內，壓力升高至 200MPa，一旦達到所需壓力值，溫度開始下降(從 310K 開始)，當溫度降至晶核形成溫度(181K)直到溫度低于約 136K，這一溫度區(qū)間內，冰晶可以形成。對于 200 mm 厚的樣品，樣品中心區(qū)域通過這一溫度區(qū)間大約需要 30ms，壓力平均值 204.5MPa。
高壓冷凍方法是目前唯一能夠將玻璃化的厚達 200 mm 的冷凍固定方法。由于高壓冷凍的樣品較厚，無法直接進行透射電鏡觀察，因此在冷凍固定后，需要使用冷凍超薄切片機在冷凍狀態(tài)下超薄切片，制得適合透射電鏡觀察的樣品方可進行冷凍透射電鏡觀察。高壓冷凍固定技術由于樣品冷凍固定的時間必須要足夠快(小于 50 毫秒)，所以局限是對樣品的大小有限制(直徑：1-2mm，最大厚度：200 mm).
2.2 冷凍傳輸
將制得的冷凍透射樣品，在液氮中轉移至低溫樣品裝載裝置，置于冷凍樣品桿上，樣品固定好之后，快速的將樣品桿拔出轉移到透射電鏡中。在樣品轉移和觀察中保持在低溫環(huán)境(通常低于 100K)。
冷凍傳輸系統(tǒng)保證了樣品從裝入樣品桿到進入電鏡的整個過程中都處于一個低溫并且相對潔凈的環(huán)境中，避免樣品在轉移過程中因為溫度的改變被破壞或者因為暴露在大氣中被污染。
2.3 低溫透射電鏡樣品的測試
目前，分析測試中心電鏡組是利用冷凍傳輸樣品桿在透射電鏡 Jem-2011 上實現(xiàn)低溫透射電鏡樣品的測試，可以滿足一部分樣品的測試需求，但是由于這臺電鏡為普通透射電鏡，所以樣品的漂移穩(wěn)定性較差，而且無法使用低劑量技術致使很多樣品的冰層容易破壞，所配置相機成像的襯度也有限，很多低襯度樣品無法進行觀察。為了獲得高分辨率、高襯度的結果，分析測試中心今年將引進一臺專門的低溫透射電鏡(Cryo-TEM)，與普通透射電鏡相比，專業(yè)的低溫透射電鏡的極靴是冷凍型極靴，即在極靴部分增加了一個冷凍盒(圖 5)。冷凍盒可以保持樣品周圍的低溫環(huán)境，既減少了樣品上冰(晶) 沉積引起的污染，也大大減少了樣品的漂移，同時配備高性能相機，顯著提高成像的襯度和速度。
具體地，低溫透射電鏡的特點包括：(1)分辨率更高，可以得到更好的高分辨成像;(2)可以使用較低的電子束，精確控制電子劑量使冰層不被打壞;(3)漂移穩(wěn)定性好，可以長時間的有效采集數(shù)據(jù)并進行三維重建;(4)可選擇過濾特定的能量，去除雜散/背底信號，提高襯度，提高信噪比;(5)可通過增加相位板、高性能相機等配件進一步提高樣品襯度及空間分辨率。
低溫透射電鏡的冷凍極靴示意圖
3.低溫透射電鏡應用實例
膠束體系對于濃度、pH、添加劑種類等液相環(huán)境條件的變化非常敏感，如果是干燥狀態(tài)其結構與有液相完全不同，因此必須用低溫透射電鏡表征其結構。通常情況下，膠束有球狀、囊泡狀、棒狀、層狀、六角束狀、洋蔥狀、蠕蟲狀等多種形狀，圖 6 是分析測試中心電鏡組用現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)觀察得到的囊泡及球狀、棒狀、短線狀膠束的透射電鏡圖，可以看出應用冷凍透射電鏡技術， 囊泡、膠束的結構被原位的真實呈現(xiàn)出來，可清晰地觀察到囊泡的完整性、分布、大小、融合等情況，而在普通電鏡條件下，干燥后的囊泡的形狀、結構很容易發(fā)生變化。
應用分析測試中現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的透射電鏡圖 a)囊泡 b)融合囊泡c)球狀、棒狀膠束 d)線狀膠束
應用分析測試中現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的的透射電鏡圖 a)帶狀聚合物 b)線狀聚合物
同樣，低溫透射電鏡也能夠有效保持聚合物在液相的形態(tài)，如上圖是應用我們現(xiàn)有的低溫透射電鏡系統(tǒng)得到的帶狀、線狀聚合物的電鏡圖，可清晰地觀察到聚合物的形態(tài)及聚集狀態(tài)。
目前，低溫透射電鏡在生物大分子的成像尤其是蛋白結構的解析方面已經(jīng)取得了諸多突破的成果，相信在化學分子材料領域也會展現(xiàn)很好的應用前景。
參考文獻
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