原標題：CRISPR專利申請淺析
CRISPR/Cas系統的發現可以追溯到1987年，研究者在大腸桿菌的基因組中首次發現了這一奇特的重復間隔序列，隨后在細菌和古細菌中被大量發現。在CRISPR技術快速發展的同時，其專利權的糾紛也隨之而來。目前，圍繞CRISPR核心專利的權利紛爭尚未定論，而加州大學與維也納大學團隊以及Broad研究所團隊已經分別將CRISPR相關專利授權給多家生物、醫藥公司；在CRISPR核心專利的權利歸屬明確后，勢必有一些引進單方團隊專利的公司將面臨巨大的經濟損失。
1、背景
CRISPR/Cas系統的發現可以追溯到1987年，研究者在大腸桿菌的基因組中首次發現了這一奇特的重復間隔序列[1]，隨后在細菌和古細菌中被大量發現。2002年科學家才將其命名為成簇的規律間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。
CRISPR/Cas系統是大部分細菌和古細菌中用來對抗外來核酸/噬菌體入侵的一種免疫系統。CRISPR/Cas系統最典型的特征是由CRISPR系統相關蛋白(Cas)，重復序列(repeats)，間隔序列(spacer)組成，重復序列和間隔序列交替排列。當病毒首次入侵時， 細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區;病毒再次入侵時，CRISPR轉錄、加工形成crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導Cas蛋白結合并切割，從而對抗外源核酸入侵。
(CRISPR-CAS系統的自適應免疫[2])
CRISPR系統根據基因的保守性和基因座的組織形式分為了三種類型，即Type I，Type II和Type III型[3]，每個類型中又可以分為幾種小類。目前廣泛應用的CRISPR/Cas9系統屬于2類Ⅱ型CRISPR/Cas系統，該系統結構簡單，僅由crRNA、tracrRNA和Cas9三種成分組成。根據tracrRNA與crRNA的結構特性，科學家們將tracrRNA和crRNA組合為一條嵌合的向導RNA(guide RNA，gRNA)，使得CRISPR/Cas9系統進一步簡化為只有gRNA和Cas9這2種組分的系統。
CRISPR/Cas系統已廣泛應用于基因治療、轉基因生物構建、藥物篩選等多個領域，推動了生物醫學的發展。2023年3月，Editas Medicine和Allergan 共同宣布，臨床試驗完成了首例患者體內給藥，其療法AGN-151587也是全球首款在患者體內給藥的CRISPR基因編輯療法。
2、CRISPR技術專利申請趨勢
2.1 申請數量
CRISPR技術自發現以來，專利申請一直處于緩慢發展的階段。2012年，Jennifer Doudna與Emmanuelle Charpentier合作，發現了一個簡單的CRISPR/Cas系統，它通過Cas9核酸內切酶以及以CRISPR序列為模板轉錄出來的兩種RNA就可以剪切dsDNA，將CRISPR/Cas9 改造成為可高效實現精準修飾靶基因特定DNA序列的工具。自此，CRISPR作為新生代的基因編輯技術，其研究熱潮迅速席卷全球，專利申請數量也大幅度攀升。
(CRISPR專利申請量變化[4])
2.2 主要申請人
目前，CRISPR/Cas系統的主要研發團隊包括Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、張峰等，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier首次提出了CRISPR/Cas系統對DNA的靶向編輯功能，并進行相關專利申請;隨后張鋒等率先開發出了可在真核細胞中進行基因編輯的CRISPR/Cas系統，并且及時申請了專利。
自此之后，張鋒課題組又先后發現了新型基因編輯工具CRISPR/Cas12a(舊稱CRISPR/Cpf1)，具有較高的基因編輯能力;同年，張峰課題組發布了來自于細菌的CRISPR/C2c2系統，后命名為CRISPR/Cas13a系統，并發現其對RNA有剪切功能。
CRISPR技術的全球專利主要申請人可見表1.其中麻省理工學院、哈佛大學、博德研究所為主要申請人，張峰作為Broad研究所(Broad Institute)教授，并創辦了Editas Medicine公司，其對CRISPR相關專利申請量遠高于其他發明人。
表 1
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序號 |
申請人 |
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1 |
Massachusetts Institute of Technology（美） |
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2 |
Harvard University（美） |
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3 |
Broad Institute（美） |
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4 |
中國科學院（中） |
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5 |
University of California（美） |
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6 |
Editas Medicine（美） |
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7 |
GE Healthcare（美） |
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8 |
DuPont Pioneer Hi-bred（美） |
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9 |
CRISPR Therapeutics（美） |
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10 |
浙江大學（中） |
2.3 技術領域
CRISPR相關專利的應用領域涵蓋醫學、農業和工業領域，其應用范圍廣，其中醫學是最大的應用領域，包括遺傳、癌癥等疾病治療，以及新藥開發等相關領域。在申請技術領域方面，如下IPC分類中占據比較大的申請比例：C12N9/22(核糖核酸酶)、C12Q1/68(包括核酸)、C12N15/113(調節基因表達的非編碼核酸，如反義寡核苷酸)，以及A61K48/00(含有插入到活體細胞中的遺傳物質以治療遺傳病的醫藥配制品;基因治療)、C12N15/90(將外來DNA穩定地引入染色體中)、C12N15/85(用于動物細胞)等。目前，CRISPR相關專利多關注于Cas蛋白改造，gRNA設計、基因結構改造、定向修飾，基因表達調控等。
2.4 技術主題
CRISPR相關專利申請具有主題類型豐富、可布局方式多樣等特點，下圖示出了目前CRISPR專利申請中主要的技術主題類型：
(CRISPR專利申請主題)
Cas蛋白與gRNA是CRISPR專利申請中占比最高的兩類技術主題。在涉及Cas蛋白的專利申請中，以Cas9蛋白為技術主題的專利申請占據主要的申請比例，此外以新發現的Cas12a、Cas13等Cas蛋白為技術主題的申請量也逐漸增多。其中，由于Cas12a蛋白與crRNA、目標核酸鏈結合后，可釋放對ssDNA的切割活性，拓展了CRISPR技術在核酸檢測領域的專利申請。
利用Cas蛋白的核酸酶活性部分喪失或全部喪失的突變體(例如，Cas9n、dCas9等)開發有一系列新型的編輯系統，例如Cas9n、dCas9與脫氨酶等蛋白融合，可用于構建對單堿基編輯的堿基編輯器。在以堿基編輯器為技術主題的專利申請中，哈佛大學、Broad研究所、比姆醫療公司等占據申請優勢。
gRNA或crRNA、tracrRNA是構成CRISPR系統的重要內容，gRNA、crRNA、tracrRNA的優化與設計對于改善脫靶率、改良編輯效率等具有積極作用，是CRISPR專利申請中的另一長期布局重點。
2.5 專利糾紛
在CRISPR技術快速發展的同時，其專利權的糾紛也隨之而來。2012年5月，加州大學的Jennifer Doudna等提交了關于CRISPR/Cas9基因編輯技術的專利申請，同時在申請中描述了CRISPR/Cas9在細菌等原核生物中的應用情況。2012年12月，張鋒基于真核細胞內的CRISPR/Cas9技術申請專利，雖然申請時間較前者晚7個月，但張鋒所在的Broad研究所通過專利申請加速程序于2014年4月15日優先通過專利審查，首次獲得CRISPR/Cas9的專利授權。
2016年，加州大學以“專利沖突”為由，針對Broad研究所的CRISPR基因編輯專利，以及另外11件相關專利向美國專利商標局專利審判和上訴委員會(PTAB)請求啟動抵觸審查程序，以確認誰先發明了CRISPR基因編輯技術。2017年，PTAB認為方專利不存在事實上的干擾，雙方持有的專利涉及不同主題的發明，判定雙方保留各自專利。隨后，加州大學正式向聯邦巡回上訴法院(CAFC)遞交上訴，指出因編輯原始應用覆蓋了所有細胞、植物、動物和人類，不止局限于細菌。2018年9月份，CAFC最后裁定維持美國專利審判與上訴委員會的判決，Broad研究所將繼續擁有在真核生物中使用CRISPR基因編輯的知識產權[5]。
2023年2月4日，PTAB進行了專利聽證會，雙方就Broad研究所是否以不正當方式獲取CRISPR的早期技術信息，以及用于真核細胞中編輯的gRNA的歸屬問題展開爭論，但目前尚未給出定論。
3、總結
目前，圍繞CRISPR核心專利的權利紛爭尚未定論，而加州大學與維也納大學團隊以及Broad研究所團隊已經分別將CRISPR相關專利授權給多家生物、醫藥公司;在CRISPR核心專利的權利歸屬明確后，勢必有一些引進單方團隊專利的公司將面臨巨大的經濟損失。
因此，如何圍繞CRISPR/Cas技術的核心改進點，結合外圍專利策略，在CRISPR 系統、Cas蛋白、gRNA、PAM及相關方法、應用等方面進行全面考量，合理統籌、布局，是未來CRISPR/Cas技術研發、商業應用過程中需要考慮的重要問題。
參考文獻：
[1]Y Ishino, H Shinagawa, K Makino, M Amemura, A Nakata . Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase ISOzyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product. J Bacteriol. 1987 Dec; 169(12):5429-33.
[2]Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.
[3]Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, Brouns SJ, Charpentier E, Horvath P, Moineau S, Mojica FJ, Wolf YI, Yakunin AF, van der Oost J, Koonin EV. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011. Jun;9(6):467-77.
[4]https://www.ipstudies.ch/crispr-patent-analytics/
[5]何雋,張虹穎. 專利訴訟與研發活動對科技公司影響的實證研究[J]. 科技管理研究, 2020. 40(6).
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