顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。顯微鏡的種類很多，在實(shí)驗(yàn)室中常用的有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗(yàn)中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。
一、普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和基本原理：
1.結(jié)構(gòu)：
光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機(jī)械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺(tái)、鏡臂和底座等。（圖３－１）
標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時(shí)需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提高分辨率，標(biāo)準(zhǔn)目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進(jìn)入物鏡，形成一個(gè)大角度的錐形光柱，因而對(duì)提高物鏡分辨率是很重要的。聚光鏡可以上下移動(dòng)，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。
顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和強(qiáng)度都容易控制。一般的顯微鏡可用普通的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。有些需要很強(qiáng)照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠础?/p>
2.原理：
顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長(zhǎng)短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長(zhǎng)或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見(jiàn)光的光波幅度比較窄，紫外光波長(zhǎng)短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長(zhǎng)來(lái)提高光學(xué)顯微鏡分辨率是有限的，提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時(shí)折射率為1，而香柏油的折射率為1.51，和載片玻璃的折射率（1.52）相近，這樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過(guò)載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分辨率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。
二、普通顯微鏡的使用方法
1、低倍鏡觀察
先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡，調(diào)好光線，將物鏡提高，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對(duì)準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點(diǎn)。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降，圖像就可以消失。聚光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮。钥刂粕淙牍饩€的量，增加明暗差。
2、高倍鏡觀察
顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡基本上也對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)，只要稍微轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)即可。有些簡(jiǎn)易的顯微鏡不是共焦點(diǎn)，或者是由于物鏡的更換而達(dá)不到共焦點(diǎn)，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角度。稍微上下移動(dòng)聚光鏡，觀察圖像是否清晰。
3、油浸鏡觀察
油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損壞。使用時(shí)，一般是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片標(biāo)本也可以不經(jīng)過(guò)低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動(dòng)止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。沒(méi)有自動(dòng)止降裝置的，對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察，將油浸鏡下移到與載玻片稍微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。
使用油浸鏡時(shí)，鏡臺(tái)要保持水平，防止油流動(dòng)。油浸鏡所用的油要潔凈，聚光鏡要提高到最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響分辨率。無(wú)論是油浸鏡或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。
三、普通顯微鏡的保養(yǎng)
顯微鏡是精密貴重的儀器，必須很好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要放回原來(lái)的鏡箱或鏡柜中，同時(shí)要注意下列事項(xiàng)：
1、觀察完后，移去觀察的載玻片標(biāo)本。
2、用過(guò)油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。
3、轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。
4、將鏡身下降到最低位置，調(diào)節(jié)好鏡臺(tái)上標(biāo)本移動(dòng)器的位置，罩上防塵套。
鏡頭的保護(hù)最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒(méi)有短絨毛的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要時(shí)可以用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團(tuán)蘸取少量的二甲苯，輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。目鏡是否清潔可以在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，如果視野中可以看到污點(diǎn)隨著轉(zhuǎn)動(dòng)，則說(shuō)明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡，擦過(guò)后用洗耳球?qū)⒍探q吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時(shí)，都要用擦鏡紙將鏡筒的口蓋好，以防灰塵進(jìn)入鏡筒內(nèi)，落在鏡筒下面的物鏡上。
四、顯微計(jì)數(shù)
利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常見(jiàn)的微生物計(jì)總數(shù)的方法。因?yàn)橛?jì)數(shù)器載片和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算單位體積內(nèi)微生物總數(shù)。
血球計(jì)數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個(gè)方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，其中間的一個(gè)大方格用來(lái)做微生物計(jì)數(shù)，所以又稱為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種，一種是每個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，每中方格又分成25個(gè)小方格。另一種是一個(gè)大方格分25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，不論哪一種，一個(gè)大方格，都等分成（25×16或16×25）400個(gè)小方格。（圖３－２）因?yàn)槊總€(gè)大方格邊長(zhǎng)為1毫米，載片與蓋片間距離為0.1毫米，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室（1個(gè)大方格）體積為0.1
圖３－２ 兩種血球計(jì)數(shù)板
a. 25X16計(jì)數(shù)板 b.16X25計(jì)數(shù)板
立方毫米。測(cè)出每個(gè)中方格菌數(shù)，就可以算出一個(gè)大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。
一個(gè)大方格是16個(gè)中方格時(shí)，應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個(gè)中方格（即100個(gè)小方格）的菌數(shù)，一個(gè)大方格是25個(gè)中方格時(shí)，除取4角4個(gè)中方格外，還要數(shù)中央一個(gè)中方格（即為80個(gè)小方格）的菌數(shù)。
計(jì)算公式如下：
16×25計(jì)數(shù)板：
總菌數(shù)/ml=
×400×10000×稀釋倍數(shù)
=每個(gè)小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)
25×16計(jì)數(shù)板：
總菌數(shù)/ml= 
×400×10000×稀釋倍數(shù)
=每小方格內(nèi)菌數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)
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