對于微量而且復雜的樣品，如蛋白質組學樣品、蛋白藥物中的殘留宿主細胞蛋白（HCP）等，不但需要高靈敏的納升級液相，而且需要更為充分的分離。在線二維納升分離技術（on-line2D NanoLC）應運而生，并已成為微量復雜樣品液質分析所必不可少的分離手段。
傳統的納升在線二維技術，一般采用強陽離子交換（SCX）作為第一維，反相色譜（RP）作為第二維的分離手段。這種方法是根據樣品在鹽溶液中的離子特性與疏水性，這兩種屬性間的正交關系實現的。但是SCX-RP技術在納升級分離中卻困難重重。困難主要來自SCX分離維度。在SCX分離中需要使用濃度較高的鹽溶液作為流動相，但含鹽流動相易發生鹽析或導致樣品在管路內沉淀，而納升液相的管路內徑又非常?。?5-100微米）。因此，在實際運用SCX-RP分離時，經常出現管路阻塞而導致實驗失敗。
為此，除提供傳統的SCX-RP分離技術外，沃特世創造性地開發了雙反相二維分離方法。（RP-RP）。這種RP-RP技術不必使用高濃度鹽溶液作為流動相，避免了離子交換分離易造成的管路阻塞問題，從而大大提高了納升二維液相的系統穩定性和實用性。更令人興奮的是，經過哈佛醫學院的JarrodA. Marto全面的實驗對比發現，較SCX-RP方法， 運用RP-RP分離技術得到的液質分析結果更好（圖1）[1] RP-RP雙反相二維方法可以幫助科學家得到更多的蛋白質分析結果.
這是因為：
1、SCX方法使用的鹽緩沖液易產生離子噪音背景，從而影響質譜數據質量；
2、SCX分離效果取決于多肽所攜帶的電荷數，而多肽攜帶電荷數量類別有限，因此第一維SCX分離度較差，造成液質數據信息質量不高。
R P-RP雙反相分離技術在第一、第二維都使用了反相色譜，那么它是如何實現二維分離所必須的分離性質的正交呢？原來，經過研究發現，在不同pH值環境下，多肽的反相保留行為是不一樣的（圖2）[2]。根據這個性質，沃特世的科學家開發出了獨有的RP-RP納升在線二維系統——nanoACQUITY UPLC® System with 2D-LC。這個系統的分離柱，使用了UPLC一貫的亞二微米顆粒填料，因此具有了UPLC的超高分離度等優點。此外，它還不需要分流就可以實現精準的納升流速，可為實驗室節省巨大的高純度流動相購買費用及廢液處理費用，而且更加環保。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相二維系統優點總結如下：
■ 較SCX-RP技術，使用RP-RP系統可得到更多的蛋白鑒定結果。
■ RP-RP系統較SCX-RP系統更穩定、耐用。
■ 與nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分離效果。
■ 不分流實現精準的納
nanoACQUITY UPLC System with2D-LC雙反相在線二維系統結構及分析流程如圖3，其中包括三根色譜柱：高pH反相柱、捕獲柱、低pH反相柱。在此系統中，第一維色譜柱為高pH色譜柱。樣品進入第一維色譜柱后，第一維梯度泵可按使用者要求，自動地階梯式提高有機相比例，以將樣品中不同疏水性肽段分批洗脫下來。從高pH反相柱上洗脫下的多肽會被富集柱捕獲。每批次被富集的多肽，將在第二維泵的線性梯度模式下進入低pH反相分析柱，在這里經過充分分離后，樣品將到達離子源，進入質譜分析器。
其中左下圖為結構示意圖。步驟①：樣品被自動進樣器采集后，在第一維梯度泵的推動下進入高pH色譜柱。步驟②：樣品在第一維泵階梯式梯度作用下，將一部分多肽沖出，后被捕獲柱富集。其中第二維梯度泵通過施加9倍于第一維泵的水相流動相，將溶劑稀釋為適合捕獲柱富集的體系。步驟③：在六通閥切換后，第二維泵通過線性梯度，將多肽樣品進行充分分離并送至質譜分析。在執行完步驟①后，步驟②與步驟③交替進行直到完成所需分析。雙反相在線二維系統nanoACQUITY UP LC System with2D-LC已經在多肽的液質分析方面被廣泛應用，幫助研究人員取得了眾多極具價值的研究成果。
參考文獻
(1) Zhou F, Cardoza JD, Ficarro SB, Adelmant GO, Lazaro JB, Marto JA.
online Nanoflow RP-RP-MS Reveals Dynamics of Multicomponent Ku Complex in
Response to DNA Damage. J Proteome
Res. 2010, 9, 6242-6255.
(2) Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC. Two-dimensionalseparation of
peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second
separation dimensions. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703.
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